El año de 1524 marca el inicio de la Época Colonial en la región centroamericana, con la llegada de los conquistadores españoles, quienes ingresaron por su parte occidental (actualmente Retalhuleu), provenientes desde la Nueva España (actualmente México). El conquistador adelantado era el capitán Pedro de Alvarado. Se enfrentó primero con los k'iches y se alió después con los cakchiqueles.Fundó la primera capital, el 25 de julio de 1524, en las cercanías de Iximché, capital de los cakchiqueles, con el nombre de Ciudad de Santiago, en honor al Apóstol y patrón de la reconquista.
El 22 de noviembre de 1527, se la capital tuvo que ser trasladada debido a las contínuas pugnas con los cakchiqueles. La nueva capital se asentó en el valle de Almolonga. Esta capital fue destruida, en la madrugada del 11 de septiembre de 1541, por un alud de lodo y piedras que provino de la cima del Volcán de Agua (Volcán Hunahpú, como lo conocían los indígenas). En el desastre, pereció la primera Gobernadora que ha tenido América: Doña Beatriz de la Cueva, viuda de Don Pedro de Alvarado, junto con casi la totalidad de los habitantes. Esto obligó a que, de nuevo, fuera trasladada. Esta vez se ubicó en el Valle de Panchoy, en lo que actualmente es la Ciudad de Antigua Guatemala. El 10 de marzo de 1542, se celebró la primera reunión de cabildo, con la que se oficialió su fundación. La ciudad, ya en su tercer asiento oficial, conservó el mismo escudo de armas otorgado en Medina de Campo por real cédula del 28 de julio de 1532. El 10 de marzo de 1566, el Rey Felipe II la condecoró con la merced del título de “Muy Noble y Muy Leal Ciudad”. Fue la tercera ciudad en importancia en América después de México y Lima.
El período colonial duró casi 300 años. Durante esa época, Guatemala fue una capitanía general y una audiencia (Capitanía General de Guatemala y Audiencia de los Confines), la que, a su vez, dependía del Virreinato de la Nueva España (hoy México).
Su territorio ocupaba desde la región del Soconusco —ahora en el sur de México (estado de Chiapas)— hasta Costa Rica. Esta región no fue tan rica en minerales y metales como México y Perú. Sin embargo, se destacó, principalmente, en la producción agrícola. Sus principales recursos fueron la caña de azúcar, el cacao, las maderas preciosas, grana y añil (los dos últimos eran tintes).
En cuanto a la educación, la región contaba con escuelas de primeras letras, tanto para indígenas, como mestizos y españoles o criollos. Los estudios universitarios tuvieron su antecedente cuando el primer obispo del reino de Guatemala, el Francisco Marroquín, fundó el Colegio Universitario de Santo Tomás, en el año de 1562. En 1676, se fundó la Universidad de San Carlos de Guatemala, la que fue una de las primeras universidades del nuevo mundo.
El presidente de la audiencia, Don Martín de Mayorga, solicitó al Monarca de España, el 21 de julio de 1775, el traslado de Antigua Guatemala, ya que, siempre vulnerable a erupciones volcánicas, inundaciones, y terremotos, esta había sido destruida por dos terremotos en 1773. La nueva ciudad de Guatemala oficializó su cuarto asentamiento el 2 de enero de 1776, con una primera sesión de cabildo, presidido por el gobernador de la Audiencia Matías de Gálvez y Gallardo, sobre las bases del llamado Establecimiento Provisional de La Ermita. Por real orden, dada en Aranjuez el 23 de mayo de 1776, se quitó el nombre de Santiago y se adoptó el de Nueva Guatemala de la Asunción, aunque en la actualidad es conocida como Ciudad de Guatemala. El 15 de septiembre de 1821, la Capitanía General de Guatemala se declaró independiente.
